技术讲座-Affymetrix芯片原理

转载自陈巍





我们这个节目，主要是为大家介绍基因组学，和临床分子诊断的最新技术进展.


今天，会和大家谈一下 Affymetrix 公司的生物芯片.


Affymetrix 公司是著名的生物芯片公司,它的芯片当中包含了：RNA表达量分析（表达谱芯片）、SNP检测（基因分型）、拷贝数变异（Copy Number Variation，CNV）、small RNA、甲基化等多种芯片。


今天我们会和大家介绍，它应用得最广的两种芯片：表达谱芯片、和SNP分型芯片。


首先，我们介绍一下 Affymetrix 的（生物芯片的）仪器，目前在售的仪器，主要有4个机型，从小到大，分别是：
1.   GeneAtlas
2.   GeneChipScanner 3000 7G（简称：7G）
3.   GeneChipSystem 3000 DX2（简称：DX2）
4.   GeneTitan


GeneAtlas 是一个小型系统，它主要可以扫描4张芯片一组的小芯片条。它的特点是：经济、易用。


GeneChip Scanner 3000 7G（7G）和GeneChipSystem 3000 DX2（DX2）。是一款机器的2个版本，其中，“7G”版是科研型版本、 “DX2”是临床版本。其中，DX2已经取得了美国FDA和中国CFDA的认证。


GeneTitan 是新机型，它的通量更大，自动化程度更高。平均到每个样本的检测成本更低。


GeneTitan在生物样本库项目（BioBank）当中，应用很多介绍完仪器，接下来，我们来介绍Affymetrix 芯片的制造过程。


制造原理


Affymetrix 芯片的制造过程，类似半导体芯片的制造过程。是通过光蚀刻来完成的。


它（生物芯片）的基片，是一张大的玻璃片，称为：“Wafer”。


首先，在玻璃基片上加上保护基团，也就是玻璃板上的这些蓝色小帽子。这些保护基团，它可以阻止接下来的DNA的延长反应。同时，这些保护基团是对光敏感的。


一旦受到紫外光的照射，这些保护基团就会从所连着的羟基上掉下来。把羟基给暴露出来。


接下来，进行光刻。我们以玻璃基片上3*2的6个小格子，这样一个小区域来说明光刻的过程。


先用一个光罩（mask 1）来遮住一部分的玻璃板区域，在光罩上，是一系列排列整齐的小方格。


有些小方格是透明的，还有一些小方格是不透明的，可以挡住光。


紫外光透过光罩（Mask 1），照到玻璃基片上。这些透明的格子所对应的地方，保护基团被紫外光照射到。


光敏的保护基团就从原来所连的羟基上掉下来，而那些不透明格子所对应的地方，因为没有被光照到，保护基团依然连接在原来的羟基上。


接下来，把要连的碱基底物加到玻璃基片上，这里第一个要加的碱基是“A”碱基，玻璃基片上刚才被光照射过的，去掉了保护基团的地方。


就会与新的A碱基结合，这样，A碱基就连接到玻璃基片上。


而刚才被光罩上不透明的区域所覆盖的，还留有保护基团的地方，就不会与新加入的“A”碱基进行结合。


请注意，这里新加进来的A碱基，也带着一个保护基团。


接着，进行第2轮的光刻，也就是拿第二张光罩盖Mask 2，盖在玻璃基片上。


紫外光再次透过光罩，照到玻璃基片上。但是请注意，这第二张光罩上的透明与不透明格子的分布。


是与第一张光罩不一样的，在第二次光照射之后，玻璃基片上对于应于第二个光罩透明的部分，上面的保护基团就掉了。


然后，我们把第二轮要种的T碱基铺到玻璃基片上，玻璃基片上，那些在第二轮光照射当中，去掉了保护基团的位置，就会长出一个T碱基。


再接着，用Mask 3进行遮盖，进行第3轮的光照射，然后，加上C碱基。


这样，不断地重复这个过程，玻璃基片上不同的位置，就会按原来的设计意图，长出我们想要的DNA链来。


这些DNA链，就是探针，这些探针，会在后面的实验当中，与目标DNA链或者RNA链，进行杂交、结合。


Affymetrix 公司芯片上的的探针，都是3’端连到玻璃基片上的。


Affymetrix 的芯片当中，做表达谱的芯片，也就是测RNA表达量的芯片，探针的长度是25个碱基，而做SNP分型的芯片，探针的长度是30个碱基。


Affymetrix 芯片上，长有相同序列DNA链的一个小点，被称为一个“Feature”。这也就是未来芯片扫描图上的一个光点，一张芯片上最多可以有680万个Feature。


每个Feature上会有几百万条相同序列的DNA探针。


这样一张大的玻璃基片，在种好所有的DNA链之后，就被裁切成一小片一小片的玻璃片，每张小玻璃片上都有一套完整的探针。每一张小的玻璃片，加上了辅助液流的外壳，再打上相应的标识，就成了一张生物芯片。


Affymetrix 公司的芯片，它所有设计的探针，都在确定的位置。在最后的芯片判读过程当中，
也是通过光点的空间位置，来知道测到的是哪个探针。


RNA芯片实验原理


接下来，我们介绍芯片的实验原理。我们先来说，表达谱的实验原理。


Affymetrix 的表达芯片，分成传统的In Vitro Transcription 芯片，也就是 IVT 芯片（In Vitro Transcription 的缩写），和新一代的 Whole Transcriptome 芯片，也就是 WT 芯片 （Whole Transcriptome 的缩写）。


其中 IVT 芯片是用 Oligo dT 引物和T7 逆转录酶来得到 cDNA 链的，所以，它得到的cDNA主要是靠近mRNA 3’位末端的cDNA。相应地，它的探针也主要针对每个基因的最后一、二个外显子来进行设计。


比较著名IVT类的芯片，有经典的 U133芯片，和较为经济的 PrimeView 芯片。


而 WT 芯片是用随机引物和 T7 逆转录酶来得到 cDNA 的，所以，它得到的 cDNA 会覆盖转录本上更多的区域，相应地，它的探针也是针对基因的整个转录本来进行设计的。


WT芯片的好处：
一、是它可以覆盖转录本上更多的区域，实验结果的代表性就会更强。
二、是它可以针对因为差异剪接所形成的不同转录本，分别设计探针，这样，就可以知道不同的转录本的表达量的变化了。
三、是它可以检测到长链非编码RNA（Long Non-CodingRNA, LncRNA)


比较著名的WT芯片有 HTA 2.0、Exon 1.0、Gene 2.0/2.1 等。


实验过程当中，先通过逆转录得到第一链的cDNA，紧接着就合成第二链的cDNA，变成双链cDNA之后，这个双链cDNA就可以作为接下来转录的模板了。


接下来，用掺有生物素标记的UTP的聚合反应底物，也就是ATP、CTP、TTP，再加上生物素标记的UTP，形成的4个单核苷酸的混合物，进行体外转录，转录得到cRNA (comple-mentaryRNA)。


因为转录的原料中含有被生物素标记的UTP，所以转录出来的cRNA片段就是带有生物素标签。


然后拿这些cRNA片段与芯片进行杂交，cRNA与芯片上的探针，依照碱基互补的原则进行杂交，杂交完了之后，用标记了藻红蛋白的链霉亲合素，也就是SAPE，对芯片进行染色（streptavidin-phycoerythrin ，SAPE）。


这其中，（SAPE上的）链霉亲合素会与cRNA上的生物素进行特异地结合；而（SAPE上的）藻红蛋白在激发光的照射下，可以发出红色荧光。


然后，再加入标记了生物素的抗链霉亲合素抗体，抗体就亲合吸附到那些已经吸附在cRNA上的链霉亲合素上。


亲合吸附完成之后，再加入SAPE。对芯片进行二次染色。


SAPE就吸附到抗体上的那些生物素上，通过上述的再次染色，可以把更多的藻红蛋白吸附到目标cRNA片段上，以增加荧光的强度。


化学反应完成之后，就可以把芯片拿到扫描仪上进行激光扫描了。


激光扫描之后，得到一张有着密密麻麻光点的图片，这张图片也就是荧光信号的矩阵，光点的X、Y轴的位置，也就是探针的ID号。


光点的（光）强度，也就对应着被杂交到的cRNA的量，而这个cRNA的量，就反映了对应基因特定mRNA转录本的表达量。


SNP分型芯片实验原理


说完了表达谱芯片，我们接下来说基因分型芯片，也就是SNP分型芯片。


Affymetrix 公司的SNP分型芯片有两种实验原理：新的是Axiom芯片，是基于连接反应的；而老的卡式芯片，是基于目标DNA片段与探针序列进行杂交。看序列是否完全配对。


我们先来说新的Axiom方法，Axiom方法中，有两种探针在起作用。


第一种探针是芯片上的捕获探针，它是30个碱基的长度。它起到的作用是把目标DNA片段，固定到芯片表面。


第二种探针是显色探针，它负责对SNP芯片进行显色。


我们先来看显色探针的设计，显示探针共分成四组，A、C、G、T各一组探针。它们都是9个碱基的长度，它们的3’末端的第一个碱基是特异的，而从第二个碱基到第9个碱基都是简并的。


这其中，3’端是C、或者G的，设计成5’端带一个生物素标签。也就是最后会被染成红色荧光。


而3’端是A、或者T的，5’端被设计成带另外一种标签，最后会被染色绿色荧光。


接下来，我们以一个“G:T”型的SNP位点为例，来进行说明。


在设计这个SNP位点的探针的时候，所设计的捕获探针，是正好到SNP位点旁边的一个碱基。


实验过程进行两轮杂交。


第一轮杂交，是目标DNA与芯片进行杂交，结果是芯片上的捕获探针会抓到相匹配的目标DNA片段，接着加入显色探针，进行第二轮杂交。
这一轮杂交，把显色探针，杂交到目标DNA片段上。


然后用连接酶进行连接，因为连接酶会对连接位点的前后几个碱基进行识别。


只有前后几个碱基都完全匹配，连接反应才会发生。


所以，利用连接酶的这种识别作用，让只有与目标DNA片段互补的显色探针，才会被连接酶连接到捕获探针上去。连接反应完成之后，把游离的显色探针都给洗掉。


再用带荧光标记的染色试剂进行染色，刚才连到捕获探针上的生物素标签，就在这个染色过程中被染上红色荧光（染料）。


反之，如果目标DNA片段上，这个位点是个“T”碱基，相应地，它的标签基团就会被染上绿色荧光基团。


染色完成之后，就可以用在激光扫描下对芯片进行扫描了，扫描过程当中，如果看到这个探针上所发出的光是单纯的红色，就可以判断这个位点的SNP型是“G”型纯合子。如果发出的荧光是单纯的绿光，那么就可以判断这个SNP位点是个“T”型纯合子，如果发出的光，既有红光，又有绿光；而且红光、和绿光的光强差不多，则可以判断这个SNP位点是个“G”和“T”的杂合子。


同样的道理，对于A：C、 A：G、 T：C、 T：G，这4种SNP情况，因为不同的基因型会发出不同颜色的荧光，所以只要看荧光的颜色、和荧光的光强，就可以分辨SNP型了。


那么对于"A:T"或者"C:G"型的SNP位点，就需要用不同的检测方案，因为 A / T 探针都是绿色荧光，而 C / G 探针都是红色荧光。


Affymetrix 对这2种SNP型，另外设计了相应的检测方案。我们拿“ A:T” 型的SNP来说明。


它针对“A”设计一个探针，再对“T”。设计一个探针。而这里设计的探针，它是盖到SNP位点上的。


请注意，这与之前第一种情况所设计的探针（颜色差异探针）不同，之前的探针是设计到SNP位点的旁边，而不是盖到SNP位点上。


这里，我们以一个5’端最后一个碱基为“A”的捕获探针为例，来看它上面所发生的化学反应。在经过第一轮的捕获杂交后，目标DNA片段与之发生杂交。


如果目标DNA片段的SNP位置上是一个“T”碱基，那么捕获探针与目标DNA片段完美匹配，接下来经过第二轮的杂交，一个显色探针杂交到它的旁边。


再经过连接反应，显色探针上的标签就连到了这个捕获探针上。反之，如果目标DNA片段上这个SNP位置上是一个“A”，那么它与捕获探针上的“A”是不匹配的。


那么在第二轮的杂交过程当中，虽然会有显色探针会停在它的旁边，但是，连接反应过程当中，因为连接酶要求严格的碱基匹配，所以连接反应不会发生。


停在它旁边的显色探针因为不能共价地连到捕获探针上。所以在接下来的洗脱过程当中，就会被洗掉。


这样，在激光扫描过程当中，如果这个探针上发出荧光，则说明对应的SNP位点上有“T”碱基。如果这个探针上不发出荧光，则说明对应的SNP位点上没有“T”碱基。


然后，再来看芯片上另一个对应的，5’端最后一个碱基为“T”的捕获探针：如果它发光，则说明SNP位点上有“A”；如果它不发光，则SNP位点上没有“A”。


把两个探针的发光情况综合来看，如果两个探针都发光，则说明这个SNP位点是一个“A”和“T”的杂合子。如果5’位末端是A碱基的探针有上荧光，而5’位末端是T碱基的探针上没有荧光，则可以判断这个SNP位点上是一个“T”的纯合子。反之，这个SNP位点是一个“A”的纯合子。


如果理解了A:T型SNP的区分原理。当然也就很容易理解C:G型SNP的区分原理了。


上述就是Axiom的检测原理，归纳一下：就是通过连接酶，对连接位点上碱基匹配的情况进行识别。只有碱基匹配，连接反应才可以发生。


如果碱基不匹配，则连接反应不能发生。


在Axiom的芯片当中，CHB1和CHB2是两款很常用的、针对中国人的SNP分型芯片。


它们有130万个SNP位点，而（Affymetrix公司的）卡式SNP芯片的原理，与Axiom的检测原理，是略有不同的。


卡式芯片不是以连接反应是否发生，作为检测的依据。


而是检测目标DNA片段，与捕获探针，之间的杂交结果。


在探针设计当中，对SNP的两种情况都设计相应的探针。


在实验过程当中，先把基因组DNA分成2份。一份用Nsp I酶进行消化；另一份用Sty I酶进行消化。


基因组DNA被消化成片段，之后，在两头连上接头。


进行PCR扩增，PCR扩增完了。之后，会得到长度主要分别在 200BP ～1100BP 之间的扩增片段。


然后再用酶把 PCR 扩出来的DNA片段进行（再次）片段化。片段化完了之后，所得到的，应该是平均长度小于 180BP片到的的片段。


接着用末端核苷酸转移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase），把带有生物素的单核苷酸，加到目标片段上。


然后，把这些带了生物素标签的目标DNA片段。与芯片进行杂交，再染色、扫描。


目标DNA片段与捕获探针杂交的，过程当中，遵循碱基互补原则。如果完全匹配，则杂交效率高。杂交到捕获探针上的目标片段就会多。反之，如果有一个碱基是不匹配的，那么杂交效率就会低许多，杂交到捕获探针上的目标片段，也就会少许多。


接下来，再经过染色，染色完了之后，进行激光扫描。


扫描过程当中，能发出荧光的探针，说明样本当中有对应基因形的DNA，如果探针不能发出荧光信号，或者发出的荧光信号很弱，则说明样本当中没有对应基因型的DNA。


如果一个SNP的两种荧光探针都发光，而且发光强度差不多，则说明样本在这个位点是一个杂合子。


以上就是卡式SNP芯片的检测原理，在卡式SNP芯片当中，“SNP 6.0”是一款很经典的芯片。
它上面有90多万个SNP位点的探针，并且同时还有94万个拷贝数变异探针。


软件


Affymetrix 分析表达谱的软件。


主要是用的 Transciptome under galtetede软件，简称TAC软件分析基因分型的软件，主要是用 Genotyping Console软件。


除了表达谱芯片、和基因分型芯片之外。


Affymetrix 公司还提供：microRNA芯片、基因调控芯片、拷贝数变异芯片


分子细胞遗传学芯片、药物遗传学芯片等，多种芯片。并且提供客户定制化服务。


有兴趣的同学，可以进一步查阅 Affymetrix 公司的官方网站(www.affymetrix.com)，或者向 Affymetrix 公司进行咨询。


以上是本期节目的全部内容，谢谢您的收看，我们下期节目再见。