基于二代测序（NGS）的肿瘤panels验证指南

文章概要：
NGS方法为使用单个平台检测多个体细胞变异提供了独特的优势，并成功地用于肿瘤标本中，用于预测靶向治疗反应，疾病诊断和预后。已经成为检测体细胞变体的首选方法，被临床实验室迅速采用。然而，这种新方法是具有挑战性的，需要进行彻底的分析验证，以确保测序结果的高质量。
“NGS肿瘤panel验证指南”的第一版提供了关于临床环境中，有针对性的对NGS验证和持续监测的共识建议，文章包括了：包括了靶向测序方法和数据分析的概述、新检测方法的注意事项以及试验验证和质量控制指标的实施建议。
该指南强调了NGS检测的开发、优化和验证，包括panel内容的选择建议、验证前进行优化;使用参考细胞系和参考物质来评估检测性能;确定每种突变类型的阳性百分比和阳性预测值;明确最低覆盖深度以及最小样本量。指南还指出，在积累验证数据之前建立试验验证协议非常重要，并且应该使用所分析的样本类型进行验证。指南还提醒：检测性能会根据被检测的基因组区域而异，因此尽管使用最好的仪器或最专业的人员，检测结果还是会出现差异。
1  靶向NGS检测肿瘤标本的概况
1.1考虑事项
（1） 是选择市场已有的靶向panel，还是自己设计，主要取决于测试患者的临床症状和待测基因。
（2） 考虑panel设计成单个基因的热点突变还是设计成相关基因的全部编码和非编码序列。这个设计很重要，因为它最终涉及panel用于检测CNA与SNV和indels的潜在能力。
（3） 另一个考虑因素是基因拷贝数是否作为分析的一部分进行评估。CNA是导致染色体区域中基因组DNA增加或丧失的结构变化，常见于实体瘤，并影响肿瘤抑制基因和致癌基因。目前对测序数据已经建立了用于评估拷贝数的算法。

1.2 NGS方法概况：包括样品制备，文库制备，测序和数据分析四个主要组成部分。
（1）样品制备：血液标本可以单独分析推断肿瘤细胞含量。实体肿瘤样本需要有经过适当训练和认证的病理学家进行微观审查，确保有足够的非坏死性肿瘤细胞才能接受NGS检测。
（2）文库制备：扩增子和捕获杂交的方法
混合杂交捕获：使用捕获探针，长于pcr引物，可以允许几个错配的存在，能更准确地确定覆盖深度和变体频率。探针为我们想要测序区域的5'和3'端的同源性设计，捕获时，探针只与我们想要测序区域结合，增加了捕获的特异性。
多重PCR扩增：多功能和可扩展的，可用于构建一系列大小的文库，如果发生等位基因脱落，引物将不匹配，导致扩增子的覆盖率低于预期。
（3）测序： Illumina NGS平台和ThermoFisher's Ion系统之间，有不同的DNA输入要求，不同的试剂成本，运行时间，读取长度和每个样品的成本。这些差异对仪器处理低质量样品的能力，检测插入/缺失能力和样品通量有影响。
（4）数据分析：NGS的数据分析流水线（别名生物信息学管道）可以分为四个主要操作：基本调用，读取对齐，变体识别和变体注释。
对4种变异不同的分析方法：
单核苷酸变异SNV：已经公布的对于SNV检测的各种生物信息学工具的比较是有帮助的。
小片段缺失插入indel：含有indel的序列读取的对齐技术是最具挑战性的，有一种专门的算法叫局部重新对齐，基本上调整每个映射读取内的碱基的局部对齐，以便最小化碱基错配的数量。
拷贝数变异CAN：CNA占任何两个基因组之间的大部分核苷酸差异。CNAs产生的单个序列读数通常在bp水平上没有序列变化，而是仅仅表示不足或者过量表达。假设深度足够的测序覆盖率，DNA含量的相对变化将反映在同一样本的平均读深度后的CNA区域内的读取数量。
结构变异SV：染色体间和染色体间重排的断点通常位于非编码DNA序列，基因的内含子，通常在高度重复的区域，因此难以捕获并映射到参照基因组。用失调末端配对方法（具有相关联的软限幅读取分析）和分割读取方法可以识别SV。

2  测试开发，优化和熟悉的注意事项
2.1 panel设计：
用于诊断和患者预后的panel通常是肿瘤特异性的，其尺寸倾向于较小，并且仅包括直接涉及肿瘤的生物学的那些基因。
设计原则：考虑特定基因的选择，考虑NGS panel中的基因数和panel大小对测序成本的影响，考虑测序深度，实验室生产力，生信分析能力，临床解读的复杂性。
建议实验室根据现有的科学证据和NGS检测的临床有效性和效用来确定基因内容。
2.2 选择测序平台和方法
（1）Illumina平台：
   优：高度的多功能性和可扩展性，可对小型和有针对性的小panel进行高度全面的测定。
         缺：需要较高的DNA和RNA起始量，且时间长，需要更全面的生物信息学的支持和相关的成本较高的仪器。
（2）ThermoFisher（赛默飞）的IonTorrent系列（半导体测序）
         优：测序时间短，是运行小panel（<50genes）和有限的DNA和RNA量的样本（活检标本）机构的首选，价格较低，有足够的内置数据分析流水线
缺：增加了在均聚物区域的错误率，可扩展性低
我们建议实验室主任在临床NGS平台选择期间应考虑以下内容：panel大小（基因数量和基因覆盖程度）; 预期测试量; 所需测试周期; 生物信息学支持的可用性; 提供商的技术创新程度，平台灵活性和可扩展性; 实验室资源，技术专长和制造商的技术支持水平。

2.3在NGS测试过程中评估潜在的错误来源
目的：确定整个过程的每个步骤发生错误的可能性，可检测性和严重性，从分析设计，方法验证和/或质量控制的角度来解决每个错误。
2.4优化和熟悉（O&F）
目的：通过物理样本的数据模型，系统的评估设计是否符合期望，该步骤经常能发现NGS测试中的未预料到的问题，并进行必要的测试更改，也提供实验室人员一个能熟悉测试程序的机会。
O&F阶段包括解决文库的复杂性，测序要求深度，使用优质参考资料的初步性能规范
（1）初步性能规范
O&F包括NGS测试从样本和文库制备到测序和分析的各个方面。

（2）文库的复杂性
杂交捕获法的文库复杂性的测量是直接的，因为序列读数具有不同的5'和3'终端，反映了杂交步骤中捕获的DNA片段的数量。
扩增子都具有相同的5'和3'末端，因此，对其文库复杂性的测量更加困难。一般用定量PCR的方法来定量文库复杂性。
建议通过稀释实验，在实验期间使用不同量的DNA输入量，对panel进行评估，或由实验室主管决定使用其他的独特分子标记的方法。
（3）确立测序深度标准
可能需要至少1000×的平均覆盖率来鉴定低肿瘤细胞性组织标本中的异质变体。对于线粒体DNA的NGS，需要至少5000×的平均覆盖率才能可靠地检测异质性变体。
我们建议每个测试的扩增子或体细胞变异体检测目标的最小覆盖深度> 250次读数。在某些有限的情况下，最小深度<250读数可能是可以接受的，但是适当性应该基于预期的检测限度，读数的质量以及假阳性或假阴性结果的容忍程度。
3  NGS测序验证
（1）验证协议（protocol）：由实验室主任批准，用明确的语句，确定样本的类型和需要解决的性能特征，可以尽可能有效地处理所有相关参数。
（2）测试验证所需样品的类型和数量：验证期间测试的每种样品类型的数量应与临床服务中要测试的预期样品类型成比例。
（3）PPA和PPV：
PPA：是真实变体已知条件下，测试系统检测到的已知变体的比例。
PPV：是真实变体已知条件下，检测到的真正阳性变体的比例。
建议为每个变体类型记录PPA和PPV（例如，SNV，小型插入，大型插入，CNA，SV）。对于不能获得59个验证样本的变体类型，实验室应通过另一个经过验证的测试补充NGS测试，直到样品数量达标，或包括适当的控制，或在报告中清楚地说明限制。
（4）重复性/可重复性：建议NGS测试步骤中至少测试三个样品，以包括所有仪器，测试人员和多批试剂。应执行复制（在运行中）和重复（运行之间）测试。
（5）可报告范围和参考范围：可报告范围是认为有效的所有测试结果的跨度。这应包括满足最低质量要求的目标区域，已验证的变体类型以及这些检测限。参考范围是正常值的范围，它是来自被认为是良性或非致病性的变体的多个基因组的汇编。
（6）检测限：不同的突变类型可能具有不同的检测下限，应确定每个变体类型的检测下限。应使用至少59个样品来建立较低的LOD。如果不能获得足够的样品，应使用灵敏度控制。
（7）干扰物质和残留物：建议应特别确定测试干扰的可能来源，并在验证过程中每次系统评估的影响。应在测定的每个步骤评估携带的风险。每次运行中都应包含模板控件，但无需通过排序进行评估。
（8）临床验证和临床实用：建议临床有效性（即临床敏感性和特异性）和NGS检测的临床应用需要在设计测试过程中进行定义，并需要在验证过程中进行评估。验证协议必须包括NGS panel内容，测试的预期用途，潜在的临床有效性和实用性以及参考。具有预测算法的多分析NGS测试需要临床验证的全面规模，并应使用为分析验证定义的准则和计算来执行。
（9）生物信息管道验证：用于变异体检测的临床生物信息学管道的验证要求的详细讨论将在AMP临床实践委员会工作组正在开发的单独的伴侣文章中报告。
（10）验证测试或平台的修改组件：建议对经过验证的NGS测试的任何补充或更改应进行补充验证，包括验证协议和摘要。在补充验证期间，应评估可能由变化引起的潜在的错误来源。补充验证应以端对端的方式包含多个已知样本。为此过程选择的样品应具体解决修改引入的潜在错误。
4  实施和质量控制指标
（1）标本要求：实验室必须验证所有潜在的标本类型（即FFPE，新鲜组织，血液/骨髓，无细胞DNA），并确定标本可接受性标准。确立最小肿瘤含量的个体要求，以便根据测定验证来确定测定的灵敏度和质量和数量的质量标准，以确保最佳性能和准确的结果。
（2）DNA要求：用荧光定量方法监测核酸（DNA，RNA）的质量和数量。
（3）文库质量和量化要求：尽量减少引物二聚体，数字PCR定量，应在O＆F和验证阶段确定适当的定量方法。
（4）分析性能质量控制核心指标：必须在验证过程中确定测定的性能要求，并且每次处理样品时必须使用相同的规格监测测定的性能。鉴于平台、具体应用和信息工具之间的固有差异，无法提供范围和阈值的具体建议，每个实验室必须定义监控所有质量指标的标准和手段，以确保最佳分析性能。
（5）控制：控制样本分3类：参考细胞系、合成DNA片段、遗传特征的细胞系。细胞系混合物（具有不同的变体和不同的VAF）是相同样品中阳性对照和敏感性对照的方便来源。
（6）验证测试：建议通过常规正交方法确认应该考虑意外或令人困惑的结果。变体确认方法的选择由实验室主任自行决定。
（7）能力测试：能力测试决定了单个实验室对特定测试或测量的性能，并用于监测实验室的持续性能。对于美国的实验室，参加能力测试是医疗保险和医疗补助服务中心认证的要求，也是“临床实验室改进修正案”下的认证要求。建议实验室参与适当的能力测试计划。